HPLC: qué es y cómo mide la pureza

Qué es la HPLC

En una HPLC se inyecta la muestra disuelta en un flujo de solvente que atraviesa, a presión, una columna rellena de partículas. Cada componente avanza a una velocidad distinta según cuánto interactúa con esas partículas y con el solvente, y sale de la columna en un momento propio, el tiempo de retención. Un detector registra lo que sale y dibuja el cromatograma: una línea con un pico por cada componente.

Para péptidos se usa sobre todo la fase reversa: una columna apolar, casi siempre C18, y un gradiente de agua y acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,1 %. Es la combinación del método publicado para el tripéptido KPV, que separa el tripéptido de sus productos de degradación. ¹ El detector mide la absorción de luz ultravioleta: a 214 o 220 nm absorbe el enlace peptídico y a 280 nm lo hacen los residuos aromáticos, triptófano y tirosina. Por eso un péptido sin aromáticos, como TB-500, apenas se ve a 280 nm.

Qué mide la HPLC y qué no

La pureza por HPLC es el área del pico del péptido dividida entre el área de todos los picos, en porcentaje. «≥ 99 %» quiere decir que, a la longitud de onda del método, el péptido representa al menos el 99 % del área.

Hay una cosa que la HPLC separa y la masa no: los diastereómeros. Un péptido con un residuo en forma D en lugar de L tiene exactamente la misma masa, y sólo la cromatografía puede distinguirlo. Es el caso de ipamorelin, que lleva dos D-aminoácidos.

Pureza de un péptido, contenido neto e identidad

Una cifra de pureza es sólo una de las tres medidas que describen la calidad de un frasco:

• Pureza. El porcentaje de área de la HPLC: qué parte de las moléculas peptídicas de la muestra es el péptido correcto, frente a secuencias truncadas o con una deleción.
• Contenido neto de péptido. Qué parte del peso del polvo es péptido; el resto es agua y contraiones de la síntesis, que no aparecen en el cromatograma peptídico. Un frasco con ≥ 99 % de pureza puede tener un contenido neto bastante menor.
• Identidad. Que el péptido sea el de la etiqueta. Dos péptidos distintos pueden coincidir en el tiempo de retención; la identidad la confirma la espectrometría de masas.

La HPLC en las fichas del catálogo

Cada ficha declara la pureza que registra el análisis HPLC de sus lotes en existencia, ≥ 99 % en casi todas, y remite al certificado de análisis del lote cuando no hay cifra, como en somatropina. En una cadena de 15 residuos o menos, la separación suele ser sencilla; en las de 39 y 44, como retatrutide o tesamorelin, las impurezas típicas de la síntesis son secuencias a las que les falta un aminoácido, y separarlas puede exigir gradientes más largos.

Preguntas frecuentes

Referencias científicas

1. Pawar KR, Mulabagal V, Smith F, et al. Stability-indicating HPLC assay for lysine-proline-valine (KPV) in aqueous solutions and skin homogenates. Biomed Chromatogr. 2015;29(5):716-21. PubMed 25298219DOI
2. Gajda PM, Holm NB, Hoej LJ, et al. Glycine-modified growth hormone secretagogues identified in seized doping material. Drug Test Anal. 2019;11(2):350-354. PubMed 30136411DOI

Péptidos del catálogo relacionados

• RetatrutideAgonista triple de los receptores de GIP, GLP-1 y glucagón, con ensayos de fase 3 publicados. $1,400 MXN10 mg
• TirzepatidaAgonista dual de GIP y GLP-1, principio activo de medicamentos con registro, con ensayos de fase 3 en obesidad y diabetes tipo 2. $1,250 MXN20 mg
• GHK-CuComplejo de cobre(II) del tripéptido GHK, descrito en estudios de reparación de tejidos y de piel que salen casi todos del mismo grupo. $449 MXN50 mg
• BPC-157Pentadecapéptido sintético estudiado sobre todo en roedores, con tres estudios piloto en personas. $650 MXN5 mg
• TB-500Fragmento acetilado de la timosina β4 que contiene su región de unión a actina, estudiado en reparación de heridas. $800 MXN5 mg
• IpamorelinPentapéptido que activa el receptor de grelina y libera hormona de crecimiento sin elevar ACTH ni cortisol en su estudio original. $1,200 MXN10 mg
• TesamorelinAnálogo de GHRH de 44 residuos, principio activo también de un medicamento que la FDA aprobó en 2010. $2,000 MXN10 mg
• EpitalonTetrapéptido Ala-Glu-Asp-Gly descrito en estudios de telomerasa y de envejecimiento. $720 MXN10 mg
• SelankHeptapéptido análogo de la tuftsina, estudiado en modelos de ansiedad y en dos estudios clínicos pequeños. $1,100 MXN10 mg
• NAD+Nicotinamida adenina dinucleótido oxidada, la coenzima redox que consumen las sirtuinas y las PARP y que baja con la edad en los tejidos. $1,100 MXN500 mg
• GlutatiónGlutatión reducido, el tripéptido γ-Glu-Cys-Gly, principal antioxidante propio de la célula. $700 MXN600 mg
• SomatropinaHormona de crecimiento humana de 191 aminoácidos obtenida por ADN recombinante, principio activo de medicamentos con registro. $2,500 MXN10 mg
• GLOWGHK-Cu, BPC-157 y TB-500 en un frasco de 70 mg, con la fórmula de 50 + 10 + 10 mg; lo publicado es de cada componente. $2,500 MXN70 mg
• KLOWLa fórmula de GLOW más 10 mg de KPV, un tripéptido antiinflamatorio, en un frasco de 80 mg. $2,800 MXN80 mg

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